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文献解读 | 综述:组织特异性hPSC-EC助力于类器官血管化(下)
发布时间:2022-03-22 13:50:23 | 浏览次数:

前文综述了血管内皮细胞的培养流程、类型、特征,在本文中,作者将通过介绍5种相对成熟的血管化类器官及器官芯片,将重点放在hPSC衍生的内皮细胞是如何与类器官共培养,使其具有组织特异性,更加完美地模拟人体内环境。

【2】血管化类器官

图4.  hPSC-EC血管化类器官的应用

2.1 肾类器官

目前,肾脏类器官的培养是通过调节hPSC对CHIR99021的暴露时间实现的。在连续培养后,细胞自发聚集形成类器官,而上皮细胞、内皮细胞和周细胞多种等细胞谱系被发现则是其功能成熟的证据。在体外,将ECs与肾脏类器官共同培养,观察到其侵入肾小球,形成管腔网络。尽管EC没有使整个类器官完全血管化,但当由化疗药物顺铂诱导时,类器官确实具有部分成熟的功能,例如内吞作用和肾毒性。最近的一项研究开发了一种肾脏类器官,它使用WNT信号调节肾单位片段的生成,产生了影响血管网络形成和稳定性的相应水平的VEGF-A,并发现 CD31和CD34阳性的内皮细胞形成于血管网络中,经历了功能和结构上的进一步成熟。结果证明该类器官可被用于进一步的体外研究,作为常染色体隐性遗传多囊肾病的模型。

图5.  hPSCs分化为血管化3D肾脏类器官

2.2 心脏类器官

因为心肌细胞(CM)来自中胚层,可以使用源自hPSC的心脏中胚层细胞生成心脏类器官。ECs和 CMs的共分化导致 ECs 具有心脏特异性,其特征类似于人和小鼠心脏微血管系统的蛋白质和基因表达。这种心脏类器官在长时间培养后显示出类似于体内胎儿到出生后转变的基因表达变化,表明功能成熟。hPSC 衍生的心脏类器官中 CM 的成熟表现:(1)人类 T 小管结构基因的高表达,这对于控制心脏收缩是必不可少的;(2) 高收缩速度;(3) 接近成人CM 的高代谢活性。最近一项使用 hPSC 衍生的心脏类器官在体外复制心脏发生的研究,也证明 EC 在心脏发生中是必不可少的,心肌分化后, ECs从内核发芽并在类器官内形成血管样网络。然后,该类器官进一步生长,显示出前-后内胚层的模式。

图6.  CD31染色显示VLs和心内膜样细胞的形成

2.3 大脑类器官

血管化对于脑类器官的成熟发展相当重要性。在一项小鼠实验中,对比植入血管的脑器官与未血管化的类器官,血管化提高了脑类器官的细胞存活率和神经元活性程度。为了在体外产生血管化的脑类器官。一项研究在hPSC衍生的皮质类器官 (hCO) 中转导 ETV2,以诱导类器官内组织特异性 EC 的分化。与体外对照 hCOs 相比,血管化的皮质类器官(vhCOs)形成了可灌注的脉管系统,具有增强细胞存活率的效果。VhCOs还表现出成熟的BBB(外周循环和中枢神经系统之间动态的生物和物理屏障)特征,具有高TEER 和屏障蛋白ZO-1、occludin和CLDN5的高表达。当皮下植入后肢小鼠模型时,vhCOs 中的血管与宿主脉管系统整合。总之,BBB特征的存在及体内外可灌注脉管系统的形成表明 ECs和hCOs的功能成熟。

2.4 小肠类器官

小肠类器官可以来源于结合hPSC分化的中胚层和内胚层细胞。使用scRNA-seq,在早期肠道类器官分化中发现了一个隐藏的EC群体。在类器官分化培养基中添加额外的 EC 诱导生长因子 VEGF、FGF2 和 BMP4 成功地诱导了肠道类器官内的EC分化,同时保持了其他细胞类型的完整性。经过2个月的培养,类器官中的 ECs 表达了一种器官特异性基因型,类似于人类胎儿肠道 ECs的基因谱。配体受体分析鉴定了小肠间充质细胞和 EC 中的 CXCL12 配体和 CXCR4 受体。据报道,CXCL12/CXCR4 信号传导在肠道成熟中发挥重要作用。类器官中信号通路的存在表明类器官内存在细胞串扰,这可以进一步完善类器官。

2.5 器官芯片——BBB

结合组织特异性hPSC-EC芯片上的器官系统是几十年前开发的,主要由微细加工方法(如硅片或 3D 打印技术)来构建一个简单但逼真的器官模型。它可以是单通道系统或多通道系统,在可控环境中概括了人体器官的结构、功能和生理学。该系统还可以结合具有精确速度的连续流体流动来模拟人体内的血流,这对于研究器官中的EC 非常有用。由于难以从多种类型的器官中获取原代细胞,因此 hPSC的使用成为用于器官芯片系统的替代方案。

目前器官芯片系统广泛用于研究 BBB,由周细胞、星形胶质细胞和BMEC组成的紧密屏障。一项研究开发了一种 BBB 器官芯片系统,该系统具有源自hPSC 的神经元和 EC。在层流流过通道后,观察到控制BBB功能成熟的流量依赖性信号通路的激活。而与仅由脑EC制成的对照芯片相比,将周细胞和星形胶质细胞纳入系统增强了 BMEC 屏障功能,葡聚糖-FITC(异硫氰酸荧光素)的渗透性较低,TEER 较高。为了测试 BBB 系统在疾病建模中的应用,神经元和 BMEC 来源于从亨廷顿病 (HD) 患者重新编程的 hPSC。实验中,来自健康供体和 HD 患者的 BMECs表现出彼此不同的生理特征,hPSC衍生细胞具有模拟生理相关功能的能力。

图7.  在器官芯片微流控装置中重建人类BBB

另一种 BBB 器官芯片模型使用原代周细胞、星形胶质细胞和 hPSC 衍生的 BMEC。在该设备上培养的细胞保持 BBB 表型长达1周。在本研究中,BMECs 在缺氧(5% O2)下分化,导致 ECs 具有高表达的 EC 粘附基因、转运基因和 VEGF-A 分泌。这种增强的 BBB 芯片模型具有传输 PGP 底物西酞普兰的能力,这是成熟 BBB 功能的标志,并且在任何其他先前的 BBB 芯片模型中都没有显示。尽管已经使用 hPSC 衍生细胞生成了越来越多的器官芯片系统,例如皮肤移植物、芯片上的肺气道和心脏-用于药物测试的肿瘤芯片,它们尚未含有组织特异性hPSC-EC。

【未来挑战】

类器官血管化尚处于起步阶段,未来组织特异性EC与类器官的共培养的挑战主要集中于以下几点:

(1)最主要的挑战是对类器官所需的组织特异性血管内皮特征了解有限,hPSC-EC的组织特异性标志物与已建立的血管内皮细胞标志物存在差异,难以确定其是否为所需的内皮细胞。因此,需要进一步的转录组学研究、功能分析以及组织特异性 EC标志物与其主要对应物的比较,以确保培养出准确的组织特异性内皮细胞。

(2)组织特异性EC的分化过程与特定组织发育过程是相互的,未来的研究应该将组织特异性EC的类器官模型与体内发育模型相结合,以探索准确的生理病理机制。

(3)目前大量数据有助于开发多种血管化类器官,但仍然缺乏广度。因此,未来值得将hPSC-EC与更多不同种类的类器官共培养,如视网膜、胰腺等,这些组织包含与脉络膜和肝脏相似的组织形态。

(4)除了解决体外挑战之外,还必须考虑血管化类器官的应用,如何将它们扩大到临床使用,是否有足够的供应来满足临床需求,采取标准化程序和步骤培养等都需考虑在内。


参考文献:

[1]Nguyen J, Lin YY, Gerecht S. The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs. Cell Stem Cell. 2021 Jul 1;28(7):1188-1204. doi: 10.1016/j.stem.2021.05.002. Epub 2021 Jun 2. PMID: 34081899.


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